Complexos imínicos de cobre com atividade antiparasitária frente à doença de chagas / Imine copper complexes with antiparasitic activity against Chagas disease

Neste trabalho foram sintetizados e caracterizados três complexos de cobre com ligantes imínicos, com o objetivo de avaliar sua atividade tripanocida. Esses complexos foram caracterizados por diversas técnicas espectroscópicas, como UV-Vis, Infravermelho e EPR, além de análise elementar e espectrometria de massa. Juntamente com outros complexos similares previamente sintetizados pelo nosso grupo, tiveram suas atividades avaliadas frente à forma tripomastigota do parasita T. cruzi, responsável pela fase aguda da doença de Chagas, por ensaios de viabilidade celular, com determinação do valor de seus IC50, concentração em que observamos a morte de 50% da cultura celular, pela metodologia denominada MTT. Todos os complexos mostraram-se eficientes frente a tripomastigotas, apresentando valores de IC50 abaixo de 10 µM, com quatro deles obtendo índice de seletividade maior que 10, fator importante para definir agentes promissores antichagásicos. Complexos selecionados também tiveram sua atividade verificada frente à forma amastigota do parasita, responsável pela fase crônica da doença, utilizando método de imageamento por microscópio de fluorescência e contagem celular. Estudos de inibição da cruzaína, uma cisteíno-protease importante para o metabolismo do parasita foram conduzidos em colaboração com o laboratório do Prof. Wagner Alves de Souza Júdice, da Universidade de Mogi das Cruzes. Quatro dos compostos testados apresentaram atividade inibitória frente a cruzaína, sendo dois de cobre, um de zinco e um ligante livre. Os estudos também permitiram diferenciar os mecanismos de inibição dos compostos, com os complexos de cobre apresentando um mecanismo de inibição clássico e o composto de zinco e o ligante livre apresentando o mecanismo de inibição competitiva parabólica com cooperatividade

In this work, three copper complexes with iminic ligands were synthesized and characterized, with the objective of evaluating their trypanocidal activity. These complexes were characterized by several spectroscopic techniques, such as UV-Vis, Infrared and EPR, in addition to elementary analysis and mass spectrometry. Together with other similar complexes previously synthesized by our group, their activities were evaluated against the trypomastigote form of the parasite T. cruzi, responsible for the acute phase of Chagas disease, by cell viability tests, with determination of the value of their IC50, concentration in that we observed the death of 50% of the cell culture, by the methodology called MTT, all presenting IC50 values below 10 µM, with four of them obtaining a selectivity index greater than 10, important factor for defining promising antichagasic agents. Selected complexes also had their activity verified against the amastigote form of the parasite, responsible for the chronic phase of the disease, using a fluorescence microscope and cell counting imaging method. Inhibition studies of cruzain, a cysteine protease important for the metabolism of the parasite, were conducted in collaboration with the laboratory of Professor Wagner Alves de Souza Júdice at the University of Mogi das Cruzes. Four of the tested compounds showed inhibitory activity against cruzain, two of copper, one of zinc and a free ligand. The studies also allowed to differentiate the mechanisms of inhibition of the compounds, with the copper complexes presenting a classic inhibition mechanism and the zinc compound and the free ligand presenting the competitive parabolic inhibition mechanism with cooperativity

Behavior of alfa-tomatine and tomatidine against several genera of trypanosomatids from insects and plants and Trypanosoma cruzi / Comportamento de alfa-tomatina e tomatidina contra vários gêneros de tripanossomatídeos de insetos e plantas e Trypanosoma cruzi

Glycoalkaloids are important secondary metabolites accumulated by plants as protection against pathogens. One of them, α-tomatine, is found in high concentrations in green tomato fruits, while in the ripe fruits, its aglycone form, tomatidine, does not present a protective effect, and it is usual to find parasites of tomatoes like Phytomonas serpens in these ripe fruits. To investigate the sensitivity of trypanosomatids to the action of α-tomatine, we used logarithmic growth phase culture of 20 trypanosomatids from insects and plants and Trypanosoma cruzi. The lethal dose 50% (LD50) was determined by mixing 107 cells of the different isolates with α-tomatine at concentrations ranging from 10-3 to 10-8 M for 30 min at room temperature. The same tests performed with the tomatidine as a control showed no detectable toxicity against the same trypanosomatid cultures. The tests involved determination of the percentage (%) survival of the protozoan cultures in a Neubauer chamber using optical microscopy. The LD50 values varied from 10-4 to 10-6 M α-tomatine. Slight differences were detected among the LD50 values of the analyzed samples, and none of them showed evidence of resistance to the action of tomatinase, as shown by some pathogenic fungi.

Os glicoalcaloides são metabólitos secundários importantes produzidos pelas plantas e estão envolvidos em sua proteção contra agentes patogênicos. Um deles, α-tomatina, é encontrado em altas concentrações em frutos de tomate verde, enquanto que, nos frutos maduros, sua forma aglicona, tomatidina, não apresenta um efeito protetor, sendo comum encontrar parasitas de tomates como Phytomonas serpens nesses frutos maduros. Para investigar a sensibilidade dos tripanossomatídeos à ação da α-tomatina, utilizamos formas de cultura em fase logarítmica de 20 tripanossomatídeos de plantas e insetos e Trypanosoma cruzi. A dose letal 50% (DL50) foi determinada, misturando 107 células das formas de cultura com concentrações de 10-3 a 10-8 M de α-tomatina durante trinta minutos a temperatura ambiente. Testes realizados com a tomatidina como controle não mostraram toxicidade detectável contra os mesmos tripanossomatídeos. Os testes foram avaliados pela porcentagem (%) de sobrevivência das formas de cultura dos protozoários observados por microscopia óptica em câmara de Neubauer. Os resultados da determinação de DL50 mostraram que esta variou entre 10-4 a 10-6 M de α-tomatina. Pequenas diferenças foram observadas entre os valores de DL50 das amostras analisadas, e nenhuma delas mostrou evidência de resistência pela ação da tomatinidase, como demonstrado em alguns fungos patogênicos.

Avaliação das atividades antibacteriana, tripanocida e citotóxica do extrato hidroalcóolico das raízes de Tradescantia sillamontana Matuda (Veludo Branco) (Commelinaceae) / Evaluation of antibacterial, trypanocidal and cytotoxical activities of the hydroalcoholic extract from the roots of Tradescantia sillamontana Matuda (Veludo Branco) (Commelinaceae)

RESUMO O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito antibacteriano e tripanocida in vitro do extrato hidroalcóolico das raízes de Tradescantia sillamontana Matuda (Commelinaceae), conhecida popularmente como veludo branco. Foi avaliada a atividade antibacteriana in vitro frente às bactérias Streptococcus mitis (CIM = 100 µg/mL; CMB = 150 µg/mL), Streptococcus mutans (CIM = 200 µg/mL; CMB = 220 µg/mL), Streptococcus sanguinis (CIM = 400 µg/mL; CMB = 425 µg/mL), Streptococcus sobrinus (CIM = 400 µg/mL; CMB = 420 µg/mL) e Bacteroides fragilis (CIM = 400 µg/mL; CMB = 430 µg/mL) pelo método de diluição em caldo. Os protozoários da família tripanossomatídeo causam doenças tropicais que costumam ser negligenciadas que costumam ser como a tripanossomíase, para a qual estão disponíveis poucos medicamentos. Neste contexto, o extrato hidroalcóolico das raízes de T. sillamontana também foi avaliado frente às formas tripomastigotas da cepa Y de Trypanosoma cruzi, com promissora atividade frente a este protozoário (IC50 = 2,4 µg/mL). Quando avaliada a atividade citotóxica frente a fibroblastos da linhagem LLCMK2, o extrato apresentou moderada citotoxicidade (CC50 = 480,37 µg/mL). Os resultados ora apresentados para o extrato hidroalcóolico das raízes de Tradescantia sillamontana Matuda demonstraram promissoras atividades antibacteriana e tripanocida, sendo uma fonte alternativa de produtos naturais com atividades contra T. cruzi e algumas bactérias do gênero Streptococcus e Bacteroides.

ABSTRACT The aim of this study was to investigate the in vitro, antibacterial and trypanocidal effect of the hydroalcoholic extract from the roots of Tradescantia sillamontana Matuda (Commelinaceae), commonly known as Veludo branco. The in vitro antibacterial activity against the standard bacteria Streptococcus mitis (MIC = 100µg/mL; MBC = 150 µg/mL), Streptococcus mutans (MIC = 200µg/mL; MBC = 220 µg/mL), Streptococcus sanguinis (MIC = 400µg/mL; MBC = 425 µg/mL), Streptococcus sobrinus (MIC = 400µg/mL; MBC = 420 µg/mL) andBacteroides fragilis (MIC = 400µg/mL; MBC = 430 µg/mL), using microdilution broth methods. Protozoans from the trypanosomatid family cause neglected tropical diseases such as trypanosomiasis, for which few drugs are available. In this context, the hydroalcoholic extract of the Tradescantia sillamontana roots was also investigated with regards to the in vitro effects against the trypomastigote forms of theY strain of Trypanosoma cruzi, showing strong activity against this parasite (IC50 = 2.4 µg/mL). When performing cytotoxic activity against fibroblasts LLCMK2 line, the extract showed moderate cytotoxicity (CC50 = 480.37 mg/mL). The results presented for the hydroalcoholic extract of the roots of Tradescantia sillamontana Matuda demonstrated effective antibacterial and trypanocidal activities and were shown to be an alternative source of natural products with activity against T. cruzi and some bacteria of the genus Streptococcus and Bacteroides.

Avaliação da atividade citotóxica e potencial antiparasitário in vitro do a-pineno e carvacrol / Cytotoxic and antiparasitic in vitro activities of a-pinene and carvacrol

A leishmaniose e a doença de Chagas tem sido um grande desafio, no que diz respeito à sua terapêutica. Devido à grande dificuldade de encontrar fármacos que garantam uma ação terapêutica eficiente e menos agressora à espécie humana, diferentes produtos naturais vêm sendo testados. Muitas espécies vegetais foram investigadas quanto à sua ação leishmanicida e tripanocida na expectativa de que seus compostos metabólicos possuam atividade antiparasitária e ausência ou baixa citotoxicidade. Neste estudo sobre bioatividade do a-pineno e carvacrol, avaliaram-se os potenciais leishmanicida e tripanocida. O carvacrol apresentou um percentual de inibição de 38,34% e 74,12% para as formas promastigotas e epimastigotas respectivamente, na concentração de 100µg/mL, apresentando uma citotoxicidade de 21,62%. O a-pineno apresentou 100% e 5,30% de inibição para as formas epimastigota e promastigota na concentração de 100 µg/mL, com citotoxicidade de 87,88%.

Leishmaniasis and Chagas Disease represent a great challenge against the modern therapeutics. Due the high difficult to find new drugs with therapeutic efficacy and low toxicity, several natural products had been screened. Many species of plants were investigated about their leishmanicidal and trypanocidal activities. Some phytocompounds are the a-pinene and carvacrol. In this work, we evaluated the bioactivities of a-pinene and carvacrol against Trypanosoma cruzi and Leishmania braziliensis cell lines. The carvacrol inhibited 38,34% and 74,12% of the promatigote and epimastigote forms, respectively at 100 µg/mL, showing a low cytotoxic activity (21,62%). The O a-pinene inhibited 100% and 5,30% against the epimastigote and promastigote forms respectively, at 100 µg/mL, showing a higher cytotoxic activity (87,88%).

Citotocixidade e atividade antiparasitária de Lygodium venustum SW / Cytotoxic and antiparasitic activity of Lygodium venustum SW

. Doenças parasitárias infecciosas como leishmaniose e doença de Chagas tem se difundido nas últimas décadas a locais onde antes não se observava sua ocorrência. São consideradas negligenciadas por assolarem países pobres e serem marginalizadas farmacologicamente. O tratamento não apresenta muitas opções de fármacos e estes demonstram relevante toxicidade contribuindo para o aparecimento de diversos efeitos colaterais. A pesquisa com produtos naturais tem se mostrado uma interessante alternativa para a procura por novos fármacos. Lygodium venustum é uma samambaia cosmopolita de hábito lianescente encontrada na encosta na Chapada do Araripe, considerada por algumas populações americanas como planta medicinal para o tratamento de dermatoses, infecções, micoses e tricomoníases. Neste estudo foi avaliada sua atividade anti-parasitária contra Leishmania brasiliensis e Trypanosoma cruzi, bem como sua citotoxicidade através de ensaios n vitro. Foram testadas a fração hexânica e o extrato etanólico obtido das folhas de Lygodium venustum em diferentes concentrações. Para os testes in vitro de T. cruzi, foi utilizado o clone CL-B5 e para Leishmania brasiliensis foram utilizadas formas promastigotas. O ensaio de citotoxicidade foi realizado com linhagens de fbroblastos. L. venustum não apresentou atividade antiparasitária clinicamente relevante na forma de extrato etanólico bruto nem como fração hexânica contra Leishmania. A fração hexânica apresentou uma atividade intermediária contra T. cruzi, porém a concentração de efeito moderado possui citotoxicidade máxima tornando-se inviável para aplicação clínica. Entretanto, a citoxicicidade apresentada poderá ser útil em pesquisas sobre atividade antineoplásica em células tumorais.

Infectious and parasitic diseases like leishmaniasis and Chagas disease have spreading recent decades to places not observed before. They are considered neglected by desolating poor countries and marginalized pharmacologically. There are not many options for the treatment and these drugs have shown signifcant toxicity contributing to the appearance of several side effects. Research on natural products has been shown to be an interesting alternative to the search for new drugs. Lygodium venustum is a cosmopolitan fern with latescence habit found on the Chapada do Araripe, considered by some American popula-tions as a medicinal plant for the treatment of skin diseases, infections, fungal infections and trichomoniasis. This study evaluated its antiparasitic activity against Trypanosoma cruzi and Leishmania brasiliensis, as well as its cytotoxicity through trials in vitro. We tested the ethanolic extract and hexane fraction obtained from the leaves of L. venustum at different concentrations. For in vitro tests of T. cruzi, we used the clone CL-B5 and for L. brasiliensis we used promastigotes. The cytotoxicity assay was performed with strains of fbroblasts. L.venustum showed no antiparasitic activity clinically relevant in the form of crude ethanolic extractor as the hexane fraction against Leishmania. The hexane fraction showed an intermediate activity against T.cruzi, but the concentration of moderate effect has maximum cytotoxicity becoming unfeasible for clinical application. However, the cytotoxicity presented may be useful in research on antineoplastic activity in tumor cells.

Avaliação da atividade anti-Trypanosoma e anti-Leishmania de Mentha arvensis e Turnera ulmifolia / Evaluation of the anti-Trypanosoma and anti-Leishmania activity of Mentha arvensis and Turnera ulmifolia

Tripanosomiasis or “Chagas disease”, caused by Trypanosoma cruzi, affect 10 million people in Latin America. Today, the chemotherapy is the only specific treatment against this disease, being the most used drugs the nifurtimox and benznidazole. Leishmaniasis is a disease caused by parasites of the genus Leishmania, mainly founded in regions with forests, as the Amazonia. Recent reports about the Leishmaniasis indicate a deficit of therapeutical drugs available against this disease and reinforce the necessity of the discovering of new drugs. An interesting approach against these diseases is the use of natural products, as the extracts of plants as Mentha arvensis and Turnera ulmifolia. For the in vitro assays against T. cruzi and Leishmania, was used the clone CL-B5 and promastigote forms, respectively. The cytotoxic assay was performed using fibroblasts. Our results indicated that M. arvensis was active against all strains assayed, inhibiting 65 e 47 percent of the assayed strains (IC50 = 192.3 and 531.9 ug/mL respectively), representing an interesting and alternative source of natural products with anti-kinetoplastida activity.

Doença de Chagas, causada por Trypanosoma cruzi, afeta cerca de 10 milhões de pessoas nas Américas. Atualmente, a quimioterapia é o único tratamento específico disponível para esta doença, onde os medicamentos utilizados são nifurtimox e benzonidazol. Leishmaniose tegumentar Americana no Brasil é causada por uma variedade de espécies de Leishmania e uma grande diversidade destes parasitos pode ser encontrada na Região Amazônica. Revisões recentes na quimioterapia de leishmaniose enfatizam as deficiências dos agentes terapêuticos atualmente disponíveis e mostram a necessidade urgente de novos candidatos. Uma alternativa para substituir esses medicamentos são extratos naturais de Mentha arvensis e Turnera ulmifolia. Foram preparados extratos etanólicos das folhas de M. arvensis e T. ulmifolia. Para os testes in vitro de T. cruzi, foi utilizado o clone CL-B5 e para Leishmania brasiliensis foram utilizadas formas promastigotas. O ensaio de citotoxicidade foi realizado com linhagens de fibroblastos. Nossos resultados indicam que M. arvensis foi eficaz contra as cepas de parasitos testadas apresentando 65 e 47 por cento de inibição em uma concentração de 500 ug/mL (respectivamente, CE50 = 192.3 e 531.9 ug/mL), sendo considerada uma fonte alternativa de produtos naturais com atividade contra T. cruzi e L. brasiliensis.

Trypanocidal activity of flavonoids and limonoids isolated from Myrsinaceae and Meliaceae active plant extracts / Atividade tripanocida de flavonoides e limonoides isolados de extratos ativos de plantas de Myrsinaceae e Meliaceae

The activity of crude extracts of three Rapanea species (Myrsinaceae) and Cipadessa fruticosa (Meliaceae) was evaluated in vitro against the trypomastigote forms of Trypanosoma cruzi. Thirty-three extracts from different organs of these species were assayed and eleven of them showed significant activity (lysis percent >50). The fractionation of an active extract from branches of R. lancifolia (99.5 percent) led to the isolation of two flavonoids: quercetin and taxifolin, which have weak trypanocidal activity. Additionally, one active extract from fruits of C. fruticosa (97.7 percent) afforded mexicanolide limonoids: cipadesin, mexicanolide, febrifugin and cipadesin A, that were slightly active on T. cruzi. Moreover, other two flavonoids (flavone and 7-methoxyflavone), previously assayed against T. cruzi, were isolated from the hexane extract from branches of C. fruticosa (100 percent). The results presented here suggest that the plants evaluated could be a source of new active compounds against T. cruzi.

A atividade de extratos brutos de três espécies de Rapanea (Myrsinaceae) e de Cipadessa fruticosa (Meliaceae) foi avaliada in vitro contra formas tripomastigotas de Trypanosoma cruzi. Foram obtidos 33 extratos de diferentes órgãos das espécies estudadas, sendo que onze deles apresentaram atividades significantes ( por cento de lise > 50) nos ensaios realizados. O fracionamento de um extrato ativo dos galhos de R. lancifolia (99,5 por cento) resultou no isolamento de dois flavonoides (quercetina e taxifolina), que apresentaram baixa atividade tripanocida. De um extrato ativo dos frutos de C. fruticosa (97,7 por cento) foram isolados os limonoides mexicanolídeos cipadesina, mexicanolídeo, febrifugina e cipadesina A, que foram moderadamente ativos sobre T. cruzi. Além disso, outros dois flavonoides (flavona e 7-metoxiflavona), previamente ensaiados contra T. cruzi, foram isolados do extrato hexânico dos galhos de C. fruticosa (100 por cento). Os resultados obtidos aqui sugerem que as plantas avaliadas podem constituir fontes de novas substâncias ativas sobre o T. cruzi.

Trypanocidal activity of coumarins and styryl-2-pyrones from Polygala sabulosa A.W. Bennett (Polygalaceae) / Atividade tripanocida de cumarinas e estiril-2-pironas de Polygala sabulosa A.W. Bennett (Polygalaceae)

A bioatividade das frações e compostos obtidos de Polygala sabulosa contra as formas epimastigota, tripomastigota sanguínea e amastigota de Trypanosoma cruzi foram avaliadas in vitro. Frações diclorometano e acetato de etila mostraram potente atividade tripanocida sob as formas epimastigotas (IC50 < 10,4 µg/mL). Análises por cromatografia em camada delgada destas frações confirmaram a presença de compostos previamente descritos (dihidroestiril-2-pironas, estiril-2-pironas e 6-metoxi-7-preniloxicumarina). Após o fracionamento da fração diclorometano por cromatografia em coluna, obteve-se o composto α-espinasterol e da fração acetato de etila obtiveram-se os compostos apigenina, quercetina e uma quercetina-3- O-glicosídeo, todos descritos pela primeira vez para o gênero Polygala. 4-metoxi-6-(11,12-metilenodioxi-14-metoxidihidroestiril)-2-pirona, 4-metoxi-6-(11,12-dimetoxi-14-metoxiestiril)-2-pirona, 6-metoxi-7-preniloxicumarina e quercetina-3- O-glicosídeo mostraram fraca atividade contra a forma tripomastigota sanguínea (IC50 < 1008,6 µg/mL). A cumarina prenilada foi o composto mais ativo contra ambas as formas epimastigota e tripomastigota, com IC50 10,5 e 88,2 µg/mL, respectivamente. A atividade hemolítica e a toxicidade celular de cada composto foram também avaliadas. Além disso, 4-metoxi-6-(11,12-metilenodioxi-14-metoxidihidroestiril)-2-pirona e 6-metoxi-7-preniloxicumarina reduziram em quatro vezes a infecção em ratos por Vero Cells nas concentrações de 100 e 50 µg/mL respectivamente. Esses resultados mostram, pela primeira vez, a atividade de compostos de P. sabulosa contra T. cruzi.

Bioactivity of fractions and compounds obtained from Polygala sabulosa against Trypanosoma cruzi epimastigote, blood trypomastigote and amastigote forms were evaluated in vitro. Dichloromethane and ethyl acetate fractions showed a strong trypanocidal activity on epimastigotes (IC50 < 10.4 µg/mL). Chromatographic analysis by TLC of these fractions confirmed the presence of previously described compounds (dihydrostyryl-2-pyrones, styryl-2-pyrones and 6-methoxy-7-prenyloxycoumarin). The dichloromethane fraction was fractioned by silica gel column chromatography to afford the compound α-spinasterol and the ethyl acetate fraction yielded apigenin, quercetin and a quercetin-3-O-glucoside, being the first description for the Polygala genus. 4-Methoxy-6-(11,12-methylenedioxy-14-methoxydihydrostyryl)-2-pyrone, 4-methoxy-6-(11,12-dimethoxystyryl)-2-pyrone, 6-methoxy-7-prenyloxycoumarin and quercetin-3-O-glucoside showed a weak activity against blood trypomastigotes (IC50 < 1008.6 µg/mL). The prenylated coumarin was the most active compound against both epimastigote and trypomastigote forms, IC50 10.5 and 88.2 µg/mL, respectively. The hemolytic activity and cell toxicity of each active compound was also assessed. Furthermore, 4-methoxy-6-(11,12-methylenedioxy-14-methoxydihydrostyryl)-2-pyrone and 6-methoxy-7-prenyloxycoumarin reduced 4 times the T. cruzi infection rate for Vero cells at 100 and 50 µg/mL, respectively. These results show for the first time active compounds against T. cruzi in P. sabulosa.